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ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析
日期：2025-07-09 05:53
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摘要：ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析樣品進(jìn)行低中高稀釋，用來檢測樣品相對(duì)于對(duì)照品的平行性，即樣品和對(duì)照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的**學(xué)特性。
如果低中高樣品的信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線合理的定量范圍內(nèi)
ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析
布局說明
增加了未包被（灰色）的分組，此分組是很有必要的，目的是為了確認(rèn)待檢測的樣品或者對(duì)照品物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)板材的非特異吸附。
樣品進(jìn)行低中高稀釋，用來檢測樣品相對(duì)于對(duì)照品的平行性，即樣品和對(duì)照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的**學(xué)特性。
如果低中高樣品的信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線合理的定量范圍內(nèi)，低中高樣品經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后的三組濃度值接近，說明樣品和對(duì)照品平行性較好，平行性較差則該樣品的檢測不能用該對(duì)照品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析一般操作流程
01酶標(biāo)板的制備：取濃度為100 ug/ml抗體，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至5ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標(biāo)板條中 (Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的空白對(duì)照，2-8℃過夜。
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時(shí)；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03抗體對(duì)照品的梯度稀釋和樣品的高中低稀釋（Note 3），100ul/孔加入微孔板中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。
04放入奧豪斯微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；
05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯漩渦混合器上混勻，100ul/孔。
07放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯(lián)抗體對(duì)應(yīng)的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ml/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘（Note 5）
12使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應(yīng)；（根據(jù)底物的不同，此步可能不需要）
13用酶標(biāo)儀測定信號(hào)值；（Note 6）
14結(jié)果分析（Note 7）
貼心的Note說明-經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
Note1：在包被過程中如果需要減少整個(gè)ELISA體系試劑對(duì)酶標(biāo)板材的非特異吸附，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗體濃度要足量2-5ug/ul。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學(xué)開發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍1000ng/ml-0.1ng/ml。
Note4：酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇，對(duì)于單抗成分的酶聯(lián)抗體如果高低兩個(gè)稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號(hào)傳遞未產(chǎn)生偏差。對(duì)于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的*高濃度時(shí)的回測來判斷酶聯(lián)抗體濃度是否合適，如果對(duì)照品較高濃度的兩個(gè)點(diǎn)信號(hào)值接近，說明多抗酶聯(lián)抗體的濃度過低。
Note 5：對(duì)于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號(hào)值和顯色時(shí)間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號(hào)線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號(hào)線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時(shí)應(yīng)控制信號(hào)值不要超過3，或者將信號(hào)值大于3的點(diǎn)不列入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。
Note 6：不同底物需要用不同的儀器進(jìn)行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。
Note 7：標(biāo)準(zhǔn)曲線的劑量曲線擬合可以是線性的，對(duì)數(shù)線性或者四參數(shù)擬合，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的回測偏差小于20%，如果不符合，刪除*高濃度點(diǎn)，直至符合標(biāo)準(zhǔn)。
ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析總結(jié)
儀器的檢測信號(hào)的線性范圍是有限的，如TMB顯色液的信號(hào)的線性范圍在0-3，ELISA方法開發(fā)和優(yōu)化過程更多時(shí)候是對(duì)于對(duì)照品的信號(hào)值的控制和調(diào)整，以使得信號(hào)值在線性范圍內(nèi)。
使用增強(qiáng)型的TMB顯色，延長顯色時(shí)間，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的*高濃度點(diǎn)，增加酶聯(lián)抗體的濃度等增強(qiáng)信號(hào)值，反之能夠降低信號(hào)值。
在信號(hào)值的線性范圍有限的情況下，盡可能的消除非特異吸附的信號(hào)值是方法靈敏的關(guān)鍵之一，選用疏水性酶標(biāo)板材，采用分子量更小的封閉劑，采用相對(duì)簡單單抗酶聯(lián)抗體或者鏈霉親和素酶聯(lián)抗體等都是有效消除非特異吸附信號(hào)的形式。
在ELISA方法學(xué)開發(fā)過程中多樣化的試劑耗材的合理選擇和搭配是一個(gè)穩(wěn)定，靈敏的ELISA方法的關(guān)鍵，而多樣化試劑材料的特性的了解是選擇的關(guān)鍵，這個(gè)需要在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中根據(jù)信號(hào)的變化系統(tǒng)的去了解和剖析。
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布局說明
增加了未包被（灰色）的分組，此分組是很有必要的，目的是為了確認(rèn)待檢測的樣品或者對(duì)照品物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)板材的非特異吸附。
樣品進(jìn)行低中高稀釋，用來檢測樣品相對(duì)于對(duì)照品的平行性，即樣品和對(duì)照品在相同的ELISA體系中是否具備相同的**學(xué)特性。
如果低中高樣品的信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線合理的定量范圍內(nèi)，低中高樣品經(jīng)稀釋倍數(shù)校正后的三組濃度值接近，說明樣品和對(duì)照品平行性較好，平行性較差則該樣品的檢測不能用該對(duì)照品作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析一般操作流程
01酶標(biāo)板的制備：取濃度為100 ug/ml抗體，室溫溶解，混勻用包被液按如下步驟稀釋至5ug/ml，按加樣布局表加入100ml/孔，分別加入酶標(biāo)板條中 (Note 1)，其中加入包被液做包被抗體的空白對(duì)照，2-8℃過夜。
02用洗滌液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封閉液(Note 2)室溫封閉1小時(shí)；洗滌液洗板3次，拍干待用；
03抗體對(duì)照品的梯度稀釋和樣品的高中低稀釋（Note 3），100ul/孔加入微孔板中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。
04放入奧豪斯微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；
05用洗滌液洗板3次，拍干；
06酶聯(lián)抗體稀釋到合適的濃度（Note 4），在奧豪斯漩渦混合器上混勻，100ul/孔。
07放入微孔板振蕩器內(nèi)，設(shè)置37℃、600rpm振蕩1小時(shí)；
08用洗滌液洗板4次，拍干；
09取酶聯(lián)抗體對(duì)應(yīng)的顯色液，臨用前20分鐘拿出平衡到室溫，在漩渦混合器上混勻；
10使用8道排槍以100 ml/孔加入顯色液；
11顯色液室溫避光放置10-30分鐘（Note 5）
12使用8道排槍以100ml/孔加入終止液終止反應(yīng)；（根據(jù)底物的不同，此步可能不需要）
13用酶標(biāo)儀測定信號(hào)值；（Note 6）
14結(jié)果分析（Note 7）
貼心的Note說明-經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
Note1：在包被過程中如果需要減少整個(gè)ELISA體系試劑對(duì)酶標(biāo)板材的非特異吸附，建議選擇疏水性酶標(biāo)板材（polysorp）,包被的抗體濃度要足量2-5ug/ul。
Note2：封閉液不一定能起到封閉效果，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（未包被抗原的分組），一般來講分子量越小的封閉劑效果越佳。
Note3：在方法學(xué)開發(fā)的初期可以拉大一下標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍1000ng/ml-0.1ng/ml。
Note4：酶聯(lián)抗體的稀釋需要做不同的稀釋度進(jìn)行比較選擇，對(duì)于單抗成分的酶聯(lián)抗體如果高低兩個(gè)稀釋度的酶聯(lián)抗體能夠產(chǎn)生一樣的劑量曲線，說明酶聯(lián)抗體過量，ELISA的信號(hào)傳遞未產(chǎn)生偏差。對(duì)于多抗成分的酶聯(lián)抗體，其稀釋度的判斷較為復(fù)雜，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的*高濃度時(shí)的回測來判斷酶聯(lián)抗體濃度是否合適，如果對(duì)照品較高濃度的兩個(gè)點(diǎn)信號(hào)值接近，說明多抗酶聯(lián)抗體的濃度過低。
Note 5：對(duì)于吸光度值底物和熒光底物，儀器檢測的信號(hào)值和顯色時(shí)間成正比，控制在10-30分鐘為宜。需要提前確認(rèn)檢測儀器的信號(hào)線性范圍，比如一般的酶標(biāo)儀吸光度值的信號(hào)線性范圍在0-3，吸光度值在3-4之間為非線性的，在顯色時(shí)應(yīng)控制信號(hào)值不要超過3，或者將信號(hào)值大于3的點(diǎn)不列入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。
Note 6：不同底物需要用不同的儀器進(jìn)行檢測，吸光度讀值，熒光讀值，化學(xué)發(fā)光讀值。在底物選擇過程中注意實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀是否具備該種類型的讀數(shù)功能。
Note 7：標(biāo)準(zhǔn)曲線的劑量曲線擬合可以是線性的，對(duì)數(shù)線性或者四參數(shù)擬合，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的回測偏差小于20%，如果不符合，刪除*高濃度點(diǎn)，直至符合標(biāo)準(zhǔn)。
ELISA定量方法學(xué)開發(fā)實(shí)際案例分析總結(jié)
儀器的檢測信號(hào)的線性范圍是有限的，如TMB顯色液的信號(hào)的線性范圍在0-3，ELISA方法開發(fā)和優(yōu)化過程更多時(shí)候是對(duì)于對(duì)照品的信號(hào)值的控制和調(diào)整，以使得信號(hào)值在線性范圍內(nèi)。
使用增強(qiáng)型的TMB顯色，延長顯色時(shí)間，增加標(biāo)準(zhǔn)曲線的*高濃度點(diǎn)，增加酶聯(lián)抗體的濃度等增強(qiáng)信號(hào)值，反之能夠降低信號(hào)值。
在信號(hào)值的線性范圍有限的情況下，盡可能的消除非特異吸附的信號(hào)值是方法靈敏的關(guān)鍵之一，選用疏水性酶標(biāo)板材，采用分子量更小的封閉劑，采用相對(duì)簡單單抗酶聯(lián)抗體或者鏈霉親和素酶聯(lián)抗體等都是有效消除非特異吸附信號(hào)的形式。
在ELISA方法學(xué)開發(fā)過程中多樣化的試劑耗材的合理選擇和搭配是一個(gè)穩(wěn)定，靈敏的ELISA方法的關(guān)鍵，而多樣化試劑材料的特性的了解是選擇的關(guān)鍵，這個(gè)需要在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中根據(jù)信號(hào)的變化系統(tǒng)的去了解和剖析。
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